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Western blot

Última atualização em 19 de agosto de 2022

Definição

O teste de Western blot detecta proteínas do sistema imunológico e tem sido usado desde o final da década de 1970. Western blotting ou imunotransferência podem identificar um ou mais anticorpos proteicos específicos de uma amostra por meio de um protocolo padrão. O protocolo de Western blot começa com a separação de moléculas maiores por eletroforese. Essas moléculas desnaturadas são então transportadas em uma membrana especialmente desenvolvida. Anticorpos específicos marcados podem então identificar um antígeno específico.

O que é Western blotting?

Western blotting é um método confiável de separar antígenos de uma amostra de proteína mista. Antígenos são substâncias estranhas que causam uma resposta imune. Os resultados de Western blot têm alta sensibilidade e alta especificidade; Isso significa que existem resultados falsos negativos muito limitados e resultados falsos positivos, respectivamente. Em termos mais simples, a alta sensibilidade fornece resultados precisos de amostras com evidências de doença e alta especificidade identifica altas taxas naqueles que não têm essa doença.

Mesmo assim, um resultado de Western blot não é seguro para falhas. Os anticorpos podem detectar mais de um tipo de antígeno. Por exemplo, se alguém está sendo testado para uma infecção pelo HIV e, ao mesmo tempo, está sofrendo de uma infecção pulmonar, os anticorpos podem captar a infecção respiratória e não relatar a presença de HIV. A precisão durante cada etapa de Western blot é essencial para aumentar a precisão dos testes.

Este teste detecta a presença de proteínas específicas dentro de um tecido misto, sangue, urina ou amostra de saliva. É usado para detectar doenças, efeitos dos produtos farmacêuticos e doping esportivo. Ele também tem um papel importante a desempenhar ao longo dos campos da pesquisa científica e clínica.

A análise de Western blot é implementada no campo da biologia molecular e nomeada em referência ao seu antecessor, o Southern Blot Test, que detecta sequências de DNA em fragmentos de DNA. Outro teste de nome semelhante é o blot do norte que identifica moléculas de RNA.

Os testes de Western blot são realizados usando as mesmas etapas; No entanto, diferentes produtos e técnicas são usados. Estes serão discutidos mais adiante.

Passos de Western blot

Existem oito passos de Western blot, todos os quais devem ser realizados com precisão:

  • Preparação de tampão de Western blot
  • Preparação de amostra
  • Separação de misturas de proteínas via eletroforese em gel
  • Transferência de proteínas separadas para uma membrana (blotting)
  • Bloqueio de membrana
  • Incubação de anticorpos
  • Detecção da proteína alvo
  • Análise de dados

Preparação de buffer

O teste de Western blot requer vários buffers que resistem a alterações no pH da amostra durante o processo de teste. Manchas – Coomassie Blue Blue e Pinceau S, por exemplo – e as soluções de destaque também devem ser misturadas e diluídas de acordo com receitas padrão.

Os tampões são usados durante a lise celular (quebra), separação de proteínas, transferência de proteínas e fases de bloqueio.

Preparação de amostra

Para realizar a análise Western blot, você primeiro precisa de uma amostra de lenços de papel. Esta amostra também precisa passar por preparação. As células da amostra são rompidas usando métodos mecânicos em baixas temperaturas. As baixas temperaturas impedem a degradação das proteínas. Os métodos de interrupção celular são:

  • Homogenização: mistura de partículas para formar uma emulsão ou solução
  • Sonicação: usando energia sonora (frequências ultrassônicas) para agitar e misturar partículas
  • Alta interrupção: homogeneização sob alta pressão

A amostra é então dividida com um buffer. O tampão de lise correto deve ser usado ou a proteína a ser estudada pode não ser suficientemente extraída.

Separação de proteínas

As amostras baseadas em tecidos são complexas. Eles contêm grandes números, tipos e estruturas de cadeias polipeptídicas menores e proteínas maiores. Eles também podem conter lipídios e carboidratos.

Cada célula contém organelas construídas parcialmente ou principalmente de proteínas, de microtúbulos a mitocôndrias. Detectar um tipo de proteína de qualquer amostra de tecido é impossível sem técnicas de laboratório, como Western blotting.

A próxima etapa de Western blot é, portanto, separar essas macromoléculas dentro de uma amostra. Enquanto a preparação rompe as células inteiras, a separação de proteínas leva isso um passo adiante. O método padrão de separação de proteínas é a eletroforese em gel. A eletroforese em gel usa uma corrente elétrica para forçar as macromoléculas através de uma laje de gel.

Uma câmara de eletroforese típica é composta por uma laje de gel sentada entre duas placas de vidro ou papel. Os espaçadores dentro da laje de gel mantêm o uniforme da câmara. Quanto mais espessa a laje, mais amostras ela pode acomodar; No entanto, o calor não se dissipará com a eficiência e isso torna os resultados menos precisos. As câmaras de eletroforese são colocadas em um tanque de eletroforese que fornece o campo elétrico necessário.

Existem dois tipos de eletroforese-um e bidimensional. O método unidimensional separa proteínas de rotina. A eletroforese bidimensional permite comparar várias amostras de proteína ao mesmo tempo e no mesmo gel. Diferentes proteínas alvo são marcadas com diferentes corantes de cores. Este artigo descreve a forma unidimensional.

Eletroforese em gel de poliacrilamida nativa (PAGE) e dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) são os métodos mais usados de separação de proteínas na análise de Western blot. Estes usam um único gel de resolução. Outro nome para resolver o gel é separar o gel.

Outros produtos químicos são adicionados imediatamente antes do teste ser realizado para polimerizar (criar cadeias moleculares) dentro do gel. Estes são adicionados sem a presença de oxigênio, pois O2 interfere no processo de polimerização. Isso significa que a câmara de eletroforese deve primeiro ser desgaseificada. A polimerização afeta o tamanho dos poros que atravessam o gel e torna o resultado final de Western blot mais preciso.

Outro gel – um gel de empilhamento – faz com que as proteínas da amostra se alinhem. Os géis de empilhamento atuam como o equivalente à linha de partida em uma corrida de cavalos, alinhando os participantes antes que eles se movam (muito mais lentamente) através do gel de resolução.

Como diferentes proteínas têm pesos moleculares diferentes, elas se movem através do gel de resolução e para uma membrana a taxas diferentes. Isso os separa um do outro.

Proteína ou transferência de Western blot

A transferência de proteínas é o resultado de uma carga elétrica que circunda as proteínas da amostra. Dentro de um campo elétrico controlado, as proteínas são lideradas e empurradas de gel para membrana. Quando as proteínas separadas atingem a membrana, elas ‘apagam’.

A transferência de Western blot ocorre molhada ou semi-seca. Outros métodos mais lentos são difusão, ação capilar e transferência de vácuo. Enquanto a eletrotransferência úmida em um tanque de eletroforese fornece resultados mais precisos, as técnicas semi-secas são mais rápidas.

A membrana blotting fica mais próxima do eletrodo positivo do tanque de eletroforese em gel e as proteínas carregadas são puxadas em direção a ele. Eles são cercados por íons carregados negativamente no início da fase de separação de proteínas. Quando uma corrente elétrica é fornecida, os produtos químicos tampão empurram íons carregados negativamente na frente e atrás das proteínas. Essas fronteiras carregadas negativamente se movem ao longo da câmara a taxas diferentes, atraídas pela carga positiva próxima à membrana. A velocidade é controlada pelo peso molecular das proteínas individuais (peneiração molecular).

As proteínas separadas finalmente pulam na membrana. Essas pilhas de proteínas, imprensadas entre íons carregados negativamente, criam linhas coradas de várias espessuras de acordo com a quantidade de amostra; Eles aparecem em diferentes níveis de acordo com o peso molecular. O tamanho dos poros afeta quantas proteínas se movem através da laje de gel – as proteínas maiores são bloqueadas por poros menores.

É possível comprar câmaras de eletroforese com proteínas pré-marcadas das quais são conhecidos os pesos moleculares precisos. Estes são chamados de géis calibrando e usados como marcadores de referência para determinar os pesos moleculares de proteínas menos conhecidas.

Bloqueio de membrana

Os buffers de bloqueio são essenciais para os resultados precisos do Western blot. Eles impedem que os anticorpos se liguem com a membrana blotting.

Após a transferência de proteínas, a membrana é saturada com proteínas, mas ainda existem áreas vazias. Como essa membrana foi desenvolvida especificamente para capturar e manter as proteínas – e como anticorpos também são proteínas – a própria membrana pode afetar o resultado final.

Sem bloqueio de membrana, um resultado de Western blot mostraria o equivalente ao ruído de fundo em uma gravação de vídeo, desbotando a imagem. Em termos de buffers de bloqueio de Western blot, esse ruído é uma fonte de sinais falsos positivos. Outro termo para o bloqueio da membrana é a investigação de anticorpos.

Os buffers de bloqueio preenchem espaços vazios dentro da membrana. Surpreendentemente, o leite desnatado em pó é um tampão comumente usado. Outros tampões de bloqueio são feitos de produtos como gelatina de peixe, albumina, soro sanguíneo e a não proteica polivinilpirrolidona (PVP).

Incubação de anticorpos

Existem dois métodos de incubação de anticorpos com base em técnicas diretas e indiretas de detecção de proteínas. O Western Blot direto usa um único anticorpo (primário) para detectar uma única proteína. Esse anticorpo marcado se liga à proteína alvo; A tag é um corante ou enzima que torna os resultados visíveis.

O método indireto de Western blot usa dois anticorpos – um anticorpo primário que se liga à proteína alvo e um anticorpo secundário marcado que reconhece e marca a posição do anticorpo primário, tornando -o visível.

Grandes quantidades de anticorpos (imunoglobulinas) são fabricadas em animais geneticamente modificados. Os anticorpos monoclonais são puramente artificiais. Eles reconhecem apenas um tipo de epítopo de antígeno – a parte de um antígeno ao qual as imunoglobulinas se ligam. Os anticorpos monoclonais são caros, mas em muitos casos fornecem resultados mais precisos e consistentes do que os anticorpos policlonais.

Os anticorpos policlonais são grupos de imunoglobulina (IG) que reconhecem vários epítopos. No entanto, cada anticorpo dentro desse grupo age como um IG monoclonal – reconhecendo um epítome em um antígeno. Quando os anticorpos policlonais são usados em Western blot, o teste é mais barato para realizar, mas há um risco maior de reatividade cruzada-a detecção de antígenos semelhantes, mas não mesmos.

Os tempos de incubação de anticorpos primários dependem de quão fácil é para o IG conectar à proteína alvo – sua afinidade de ligação. Os tempos médios são de aproximadamente duas horas à temperatura ambiente (20 ° C ou 68 ° F) ou durante a noite a temperaturas de 4 ° C (39,2 ° F). Os tempos excessivos de incubação produzem mais ruído de sinal.

Para incubação indireta, a membrana deve ser lavada no tampão de lavagem apropriado várias vezes antes de aplicar o anticorpo secundário. Os tempos de incubação de anticorpos secundários são aproximadamente os mesmos da aplicação primária de anticorpos.

Detecção da proteína alvo

Os métodos de detecção variam com as técnicas de Western blot, segundo as quais as etiquetas de anticorpos foram usadas. Os rótulos de anticorpos podem ser detectados com o olho nu ou com o uso de filme de raios-X, câmeras de sensor de luz (dispositivo acoplado a carga), imagens digitais fluorescentes e instrumentos de espectroscopia no infravermelho próximo.

Antes da detecção, todos os anticorpos primários ou secundários precisam ser lavados da membrana. Isso impede que mais reações ocorram.

A boa visualização de proteínas é essencial para a análise correta dos resultados. A baixa detecção de proteínas é geralmente causada por erros humanos ou soluções, materiais e equipamentos contaminados, com defeito ou desatualizados.

Análise de dados

A análise dos dados de Western blot hoje geralmente requer a conversão de varreduras de membrana em formato digital.

Os valores das bandas de proteínas são medidos comparando -os a um marcador do qual o peso molecular é conhecido.

A análise precisa levar em consideração vários fatores importantes:

  • Limite de detecção: Algumas proteínas não são tão facilmente detectadas.
  • Estabilidade do sinal: Outras reações, como a contaminação bacteriana, podem fazer com que os sinais desapareçam ou até desapareçam com o tempo.
  • Faixa dinâmica linear: quando o limite de detecção é bom, a faixa dinâmica – a proporção da quantidade de proteína para a intensidade do sinal – é linear.
  • Razão sinal / ruído: proteínas semelhantes às proteínas alvo também são detectadas-elas criam ruído de fundo para qualquer sinais de proteína-alvo.

Análise de Western blot

Embora os resultados da análise de Western blot sejam comumente usados para detectar a presença de doença, outros usos médicos se aplicam. A pesquisa farmacêutica analisa como os medicamentos afetam outros tecidos, por exemplo. Muitas empresas fabricam anticorpos especificamente para testes de Western blot. No entanto, nosso conhecimento de anticorpos específicos é limitado-se esses anticorpos produzidos podem detectar antígenos menos estudados é uma fonte de debate.

Para produzir anticorpos de Western blot, os animais são geneticamente modificados para não conter o gene que produz a proteína a ser estudada. Isso significa que, quando exposto a ele, o sistema imunológico do animal vê a proteína como um invasor estrangeiro; Começa a produzir anticorpos para destruí -lo. O animal geneticamente modificado é chamado de animal nocaute. Muitos laboratórios produzem seus próprios animais nocauteados, em vez de comprar anticorpos prontos.

Saber ler um Western blot é relativamente simples. As bandas recebem um resultado positivo ou negativo. Nem todos os resultados são claros. Os tamanhos das bandas são representados por um número precedido pela letra P ou seguidos pelo KDA (peso molecular da proteína em Kilodaltons). O P refere -se a uma densidade de proteína especificada dentro da amostra.

Os resultados do Western blot HIV escolhem as proteínas do vírus da imunodeficiência humana. Ele mede quatro proteínas: glicoproteínas 160 e 120 e antígenos p24 e p31. Os resultados positivos devem mostrar, no mínimo, um dos conjuntos de glicoproteínas e antígeno.

Os resultados de Western Blot Lyme para essa doença transmitida por carrapatos são 97% precisos, mas apenas em pessoas que desenvolveram artrite de Lyme ou cardite de Lyme. As proteínas bacterianas detectadas são de Borrelia Burgdorferi transmitida pelo sangue.

O teste de detecção de Herpes da Universidade de Washington costumava ser o padrão-ouro nos testes, mas desde então demonstrou produzir resultados falsos positivos muito altos. Os testes secundários são frequentemente necessários, tornando este um método caro de triagem.

Western blot vs Elisa

Elisa significa ensaio imunossorvente ligado a enzimas e trabalha da maneira oposta como o Western blot. Em vez de detectar antígenos por meio de anticorpos, ELISA analisa a presença de anticorpos, ligando -os a antígenos conhecidos.

Se uma pessoa foi infectada com um vírus no passado, mas não está mais doente, o Western blot não captará esses antígenos virais, pois não há vírus restantes no corpo. No entanto, o ELISA pode detectar os anticorpos que foram produzidos após uma infecção anterior.

Os pesquisadores agora estão analisando o uso da proteína N195 como um antígeno para a detecção de Western blot de uma infecção ativa do coronavírus SARS. Elisa, por outro lado, já está disponível na forma de kit para detectar a presença de dois tipos de imunoglobulinas associadas à covid. Se a IgM for detectada, isso indica doença de início precoce. A detecção de IgG sem níveis anormais de IgM indicaria uma infecção passada.

Bibliografia

Aparecer esconder

Burgess RR, Deutscher MP (eds). (2009). Métodos em enzimologia: volume 463, Guia para purificação de proteínas. San Diego, Elsevier Science Publishing Co Inc. Mahmood T, Yang, PC. (2012). Western blot: Técnica, teoria e solução de problemas. Jornal norte -americano de ciências médicas. 4 (9), 429-434. https://doi.org/10.4103/1947-2714.100998

  • Burgess RR, Deutscher MP (eds). (2009). Métodos em enzimologia: volume 463, Guia para purificação de proteínas. San Diego, Elsevier Science Publishing Co Inc.
  • Mahmood T, Yang, PC. (2012). Western blot: Técnica, teoria e solução de problemas. Jornal norte -americano de ciências médicas. 4 (9), 429-434. https://doi.org/10.4103/1947-2714.100998

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