Definição de eletroforese em gel
A eletroforese em gel é um procedimento usado para separar moléculas biológicas por tamanho. A separação dessas moléculas é alcançada colocando -as em um gel com poros pequenos e criando um campo elétrico no gel. As moléculas se moverão mais rápido ou mais lento, com base em seu tamanho e carga elétrica.
Visão geral da eletroforese em gel
O processo de eletroforese em gel funciona porque as moléculas carregadas negativamente se afastam do pólo negativo da corrente elétrica e das moléculas menores se moverão mais rapidamente que as moléculas maiores. Assim, uma separação de tamanho é alcançada dentro do pool de moléculas que passam pelo gel. O gel funciona de maneira semelhante a uma peneira separando partículas por tamanho. A eletroforese trabalha para mover as partículas, usando sua carga elétrica inerente, através da peneira.
Quando os pesquisadores estão tentando distinguir entre diferentes segmentos de DNA, por exemplo, o processo é simples. As amostras são carregadas em canais no início do gel. Cada molécula de DNA tem a mesma carga (-1), porque o DNA é formado pelos mesmos 4 nucleotídeos e sempre carrega uma carga ligeiramente negativa, independentemente do seu tamanho. Portanto, cada molécula de DNA terá a mesma força puxando -a através do gel.
No entanto, o tamanho de cada molécula dificulta seu progresso através do gel. Moléculas grandes atingem partes da matriz de gel e são lentas. Pequenas moléculas de DNA podem deslizar entre os vários componentes da matriz de gel e rapidamente chegar ao outro lado do gel. Após um certo período de tempo, as moléculas de DNA tingidas podem ser vistas agregando em diferentes áreas do gel, com base em quão longe elas se moveram durante a eletroforese em gel. Isso permite que os pesquisadores identifiquem os segmentos e comparem o DNA de diferentes organismos.
Para que serve a eletroforese em gel?
O objetivo da eletroforese em gel é visualizar, identificar e distinguir moléculas que foram processadas por um método anterior, como PCR, digestão enzimática ou condição experimental. Freqüentemente, misturas de ácidos nucleicos ou proteínas coletadas de um experimento/método anterior são executadas através da eletroforese em gel para determinar a identidade ou diferenciar entre moléculas.
Etapas de eletroforese em gel
As etapas amplas envolvidas em um protocolo comum de eletroforese em gel de DNA:
1. Preparando as amostras para correr
O DNA é isolado e pré -processado (por exemplo, PCR, digestão enzimática) e composta em solução com algum corante azul básico para ajudar a visualizar o movimento da amostra através do gel.
2. Uma solução de gel de agarose TAE é preparada
O tampão TAE fornece uma fonte de íons para a configuração do campo elétrico durante a eletroforese. A concentração de peso a volume de agarose no tampão TAE é usada para preparar a solução. Por exemplo, se for necessário um gel de agarose a 1%, 1g de agarose será adicionado a 100 ml de TAE. A porcentagem de agarose usada é determinada pelo tamanho ou pequeno que o DNA deve ser. Se alguém está olhando para separar um pool de bandas de DNA de tamanho menor (<500bp), é preparado um gel de agarose porcentagem mais alto (> 1%). A maior porcentagem de agarose cria uma peneira mais densa para aumentar a separação de pequenas diferenças de comprimento do DNA. A solução de agarose-tae é aquecida para dissolver a agarose.
3. lançar o gel
A solução TAE de agarose é derramada em uma bandeja de fundição que, uma vez que a solução de gel esfriou e solidificada, cria uma laje de gel com uma fileira de poços no topo.
4. Configurando a câmara de eletroforese
O gel sólido é colocado em uma câmara cheia de tampão TAE. O gel está posicionado para que os poços da câmara sejam mais próximos do eletrodo negativo da câmara.
5. Carregando o gel
Os poços da câmara de gel são carregados com as amostras de DNA e, geralmente, uma escada de DNA também é carregada como referência para tamanhos.
6. Eletroforese
Os fios negativos e positivos estão conectados à câmara e a uma fonte de alimentação onde a tensão é definida. A ativação da fonte de alimentação configura o campo elétrico e as amostras de DNA carregadas negativamente começarão a migrar através do gel e longe do eletrodo negativo em direção ao positivo.
7. Parando a eletroforese e visualizando o DNA
Uma vez que o corante azul nas amostras de DNA migrou pelo gel o suficiente, a fonte de alimentação é desligada e o gel é removido e colocado em uma solução de brometo de etídio. O brometo de etídio se intercala entre o DNA e é visível na luz UV. Às vezes, o brometo de etídio é adicionado diretamente à solução de gel de agarose na etapa 2. O gel corado com brometo de etídio é então exposto à luz UV e uma imagem é tirada. As bandas de DNA são visualizadas de cada faixa correspondente a um poço de câmara. A escada de DNA que foi carregada também é visualizada e o comprimento das faixas de DNA pode ser estimado. Um exemplo é dado na figura abaixo.
Tipos de eletroforese em gel
Existem dois tipos de eletroforese em gel: nativo e desnaturação. A eletroforese em gel nativa geralmente tenta manter o RNA ou a proteína em sua estrutura nativa enquanto a executa através do gel. A eletroforese em gel desnaturante tenta reduzir o RNA ou a proteína em sua estrutura mais linear antes ou durante a eletroforese em gel.
A desnaturação do RNA ou proteína é realizada adicionando um agente redutor à amostra, gel e/ou tampão. O agente redutor separa as ligações dentro da molécula de RNA ou proteína e, assim, reduz sua estrutura secundária. A estrutura secundária de uma proteína ou RNA influenciará, de maneira não linear, a rapidez com que migra através de um gel. Uma forma linear desnaturada de RNA ou proteína, no entanto, migrará proporcionalmente ao seu tamanho linear (pares de bases ou quilo daltons). A eletroforese em gel desnaturante é frequentemente mais precisa para identificação de tamanho, enquanto a eletroforese em gel nativa é geralmente usada para identificar complexos proteicos maiores.
Exemplos de eletroforese em gel
- A eletroforese em gel de agarose de Tae é mais comumente usada para DNA.
- A página de desnaturação (eletroforese em gel de poliacrilamida) são comuns para a separação do RNA.
- Página SDS é uma eletroforese em gel desnaturante comumente usada para identificação e separação de proteínas.
Questionário
1. O gel na eletroforese em gel é análogo a que aparelho?
2. O que realiza a eletroforese em gel?
3. Identifique um motivo para executar uma eletroforese em gel nativa versus desnaturação.
4. Um cientista cria um gel para executar uma eletroforese em gel. Uma vez lançado, ele carrega as células do gel com várias amostras de DNA. No entanto, ele esquece de conectar os terminais elétricos à fonte de alimentação. Qual das seguintes opções acontecerá?
5. Um cientista executa eletroforese em gel em várias amostras de DNA. Algumas das amostras chegam muito mais longe ao longo do gel. Qual das alternativas a seguir é verdadeira para essas amostras?
Digite seu e -mail para receber resultados:
Última atualização em 19 de agosto de 2022