Definição do CRISPR
As repetições palindrômicas curtas (CRISPR) intercaladas regularmente em cluster são curtas, repetindo alongamentos de DNA encontrados na maioria das archaea e muitas bactérias. As proteínas CRISPR e CRISPR (CAS) formam um sistema imunológico adaptativo que protege contra elementos genéticos estrangeiros, como vírus, plasmídeos e transposons. O sistema CRISPR/CAS9 também fornece a base para uma ferramenta de edição de genoma que pode ser usada para modificar permanentemente genes de maneira específica e direcionada.
Recursos de Loci Crispr
Os locos do CRISPR são compostos por uma sequência de líderes ricos em AT, seguida por várias repetições de nucleotídeos curtas separadas por regiões espaçadoras. Muitas das repetições são palindrômicas, com a estrutura secundária de gancho de cabelo de RNA prevista, enquanto outros carecem de simetria e prevêem formar RNA não estruturado. As repetições são conservadas dentro de um locus CRISPR, enquanto os espaçadores são altamente variáveis e correspondem ao DNA adquirido da exposição ao DNA estrangeiro, como vírus e plasmídeos. O comprimento das repetições e espaçadores do CRISPR varia; As repetições têm 23-55apa-de-parada de comprimento, e os espaçadores têm 21-72apações de base. As matrizes CRISPR geralmente estão localizadas adjacentes a grupos de genes CAS. Os genes CAS codificam uma ampla variedade de proteínas que possuem domínios funcionais encontrados em helicases, nucleases, polimerases e outras proteínas de ligação a nucleotídeos. As proteínas CAS têm funções na aquisição de DNA espaçador, processamento de RNA e ligação e clivagem do alvo. Os locos do CRISPR foram identificados em aproximadamente 90% da archaea e 40% das bactérias, e o genoma de um organismo pode conter um ou muitos locos CRISPR (até 18 foram observados em um único organismo).
Classes e tipos CRISPR
Existem duas classes de sistemas CRISPR/CAS, denominados sistemas de Classe 1 e Classe 2. Classe 1 utilizam várias proteínas CAS para clivar o DNA estranho, enquanto os sistemas de classe 2 usam uma única proteína CAS. As classes são divididas em tipos; A classe 1 contém os tipos I, III e IV e Classe 2 contém os tipos II, V e VI. Os tipos são definidos por um gene geralmente encontrado apenas nesse tipo, bem como os genes CAS adicionais presentes. Os tipos são divididos em 19 subtipos.
Função e mecanismo de crispr em procariontes
O CRISPR fornece aos procariontes imunidade adquirida contra elementos genéticos invasivos. Esses loci incorporam material genético de vírus e plasmídeos e o usam para atingir elementos genéticos estrangeiros de maneira específica da sequência. As etapas envolvidas na proteção contra elementos genéticos estrangeiros usando o sistema CRISPR/CAS são a aquisição do DNA espaçador do vírus invasor, a biogênese do RNA CRISPR (crRNA), que permitirá o reconhecimento do DNA estrangeiro e a interferência, na qual o DNA invasivo é reconhecido e clivado.
Aquisição de DNA espaçador
Quando uma célula procariótica é invadida por um vírus, porções do DNA viral são amostradas e incorporadas nas regiões espaçadores do locus crispr. As enzimas nuclease Cas1 e Cas2 estão envolvidas na aquisição de espaçadores em E. coli e provavelmente todos os sistemas CRISPR/CAS, pois são as únicas proteínas CAS que são conservadas em todos os sistemas. O DNA que é amostrado e incorporado aos loci do CRISPR, pois os espaçadores podem estar localizados ao lado dos motivos adjacentes do Protoespacer (PAMs) dentro do genoma viral; Os PAMs são importantes na seleção de ácidos nucleicos estranhos nos sistemas Tipo I e Tipo II. Os espaçadores geralmente são adicionados ao lado da sequência do líder, embora o novo espaçador também possa ser inserido aleatoriamente na matriz de repetições.
biogênese do crRNA
Após a incorporação do DNA estrangeiro em um locus CRISPR, a sequência CRISPR é transcrita e processada em pequenos crRNAs interferentes. A matriz de repetições de espacadores é inicialmente transcrita para uma única transcrição, que é então processada pelas proteínas CAS em crRNAs, que mais tarde servem como um guia no direcionamento dos ácidos nucleicos estranhos. A biogênese do crRNA difere em diferentes sistemas CRISPR. Em certos sistemas do tipo I, as proteínas CAS se separam na borda dos loops-tronco na transcrição longa para produzir crRNAs menores. Nos sistemas tipo II, é transcrito um crRNA trans-ativador (tracrRNA), que é complementar às repetições do CRISPR, resultando na formação de RNA de fita dupla (dsRNA). O dsRNA é clivado por rnasiii para produzir crRNAs.
Interferência
Durante o estágio de interferência, os CRRNAs se associam às proteínas CAS para formar um complexo que reconhece, alvo e destrói o material genético viral. O CrRNA Basepairs com a sequência complementar no DNA viral, marcando -o para destruição. O reconhecimento da sequência PAM também pode ser necessário para o reconhecimento do DNA estrangeiro. Nos sistemas Tipo II, o Cas9 realiza a etapa de interferência usando um crRNA e tracrRNA que lhe permitem reconhecer o DNA estrangeiro. Além de reconhecer sequências -alvo, o Cas9 possui atividade endonuclease e cliva o DNA estrangeiro.
A figura mostra como o sistema CRISPR/CAS se defende contra elementos genéticos estrangeiros em procariontes.
Sistema CRISPR/CAS9 como uma ferramenta de edição de genoma
O sistema CRISPR/CAS foi explorado como uma técnica de biologia molecular para edição de genoma direcionada. A edição do genoma é realizada usando o sistema CRISPR/CAS9. A proteína Cas9 é uma endonuclease de DNA que usa um RNA guia para atingir e clivar o DNA. O Cas9 nativo utiliza um RNA guia composto por crRNA e RNA crispr de ativação trans-ativador (tracrRNA); Para fins de edição do genoma, esse sistema foi simplificado por fundir crRNA e tracrRNA para formar um RNA de guia único. O sistema CRISPR/CAS9 também pode incluir um modelo de reparo, utilizado no reparo do DNA por meio de união não homóloga ou reparo direcionado à homologia. Ao alterar a sequência do RNA do guia, o sistema CRISPR/CAS9 pode ser usado para atingir qualquer sequência de DNA e knockdown, ativar ou modificar a sequência desejada. Os componentes do sistema CRISPR/CAS9 são frequentemente incorporados a um plasmídeo usado para transfectar células para a edição do genoma. Várias alterações podem ser feitas simultaneamente; Em um caso, 62 genes foram modificados de uma só vez.
Ativação e repressão gene
O CRISPR que não possui atividade de nuclease (denominado DCAS9) pode ser usado para atingir uma sequência específica para ativação ou supressão. Ao eliminar a capacidade de cortar o DNA, o sistema CRISPR/CAS9 pode ser usado para atingir genes sem clivá -los. Cas9 sem atividade de nuclease sozinha bloqueia a transcrição em células bacterianas; Nas células de mamíferos, proteínas adicionais são incorporadas. Os fatores de transcrição também podem ser acoplados ao CAS9, permitindo a ativação dos genes alvo.
Alterando a sequência genética
Um modelo de reparo de DNA pode ser incluído no sistema CRISPR/CAS9, que permite que essa sequência de DNA seja incorporada no local desejado. O modelo de reparo se estende além da localização da seção clivada do DNA. Depois que a quebra do DNA é introduzida, a maquinaria de reparo de DNA da célula usa o modelo para reparar o DNA, alterando permanentemente a sequência do DNA.
Aplicações CRISPR
A tecnologia CRISPR pode ser usada para fazer alterações genéticas precisas em diversos tipos e organismos de células, incluindo ratos, plantas, peixes e células humanas. O CRISPR pode ser usado para gerar modelos animais de doença, derrubando ou direcionando um gene de interesse. O CRISPR também pode ser usado para gerar linhas celulares que contêm mutações causadoras de doenças e podem ser usadas para estudar os mecanismos moleculares da doença. O CRISPRS também possui aplicativos de terapêutica promissores; Eles podem ser eficazes no direcionamento de vírus, como o herpesvírus e a prevenção de sua replicação em humanos, foram usados para tratar distúrbios genéticos em animais e foram aprovados para ensaios clínicos no tratamento do câncer. Além das aplicações biomédicas, o CRISPR também pode ser usado para projetar cepas de leveduras produtoras de biocombustíveis e culturas alimentares.
Questionário
1. O sistema CRISPR/CAS fornece imunidade adaptativa contra elementos genéticos estrangeiros em que tipos de organismos? A. Bactérias B. Archaea C. Eukaryotes D. A e B
Resposta à pergunta nº 1
D está correto. Locos CRISPR são encontrados em ~ 40% das bactérias e ~ 90% da Archaea, onde fornecem ao organismo imunidade adquirida contra vírus e plasmídeos.
2. O que o Cas9 faz após a ligação do DNA que é complementar ao seu RNA guia? A. replica -o B. corta C.
Resposta à pergunta nº 2
B está correto. O Cas9 é uma endonucleases de DNA que clica o DNA que detecta ser complementar ao seu RNA guia.
3. Qual das alternativas a seguir não é uma característica do CRISPR? A. contêm repetições de DNA palindrômico B. têm regiões espaçadoras altamente conservadas C. Forneça imunidade adaptativa a bactérias e archaea D. Usado como uma ferramenta de biologia molecular para edição de genoma
Resposta à pergunta nº 3
B está correto. Os loci do CRISPR contêm regiões espaçadoras que não são conservadas. Por outro lado, eles são altamente variáveis e correspondem a elementos genéticos invasivos adquiridos de vírus e plasmídeos.
Referências
- Chen, K.Y. e Knoepfler, P.S. (2016). “Para Crispr e além: a evolução da edição do genoma nas células -tronco”. Medicina regenerativa. 11 (8): 801-816.
- Doetschman, T. e Georgieva, T. (2017). “Edição de genes com nuclease dirigida por RNA CRISPR/CAS9”. Pesquisa de circulação. 120 (5): 876-894.
- Patterson, A.G., Yevstigneyeva, M.S. e Fineran, P.C. (2017). “Regulação dos sistemas imunológicos adaptativos do CRISPR-CAS”. Opinião atual em microbiologia. 37: 1-7.
- Salsman, J. e Dellaire, G. (2017). “Edição de genoma de precisão na era do CRISPR”. Bioquímica e biologia celular. 95 (2): 187-201.
Última atualização em 19 de agosto de 2022