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Sequenciamento de DNA

Última atualização em 19 de agosto de 2022

Definição de sequenciamento de DNA

O sequenciamento de DNA é o processo de determinar a sequência de nucleotídeos dentro de uma molécula de DNA. O DNA de todo organismo consiste em uma sequência única de nucleotídeos. Determinar a sequência pode ajudar os cientistas a comparar o DNA entre os organismos, o que pode ajudar a mostrar como os organismos estão relacionados.

Visão geral do sequenciamento de DNA

Isso significa que, ao sequenciar um trecho de DNA, será possível conhecer a ordem em que as quatro bases nucleotídicas – adenina, guanina, citosina e timina – ocorrem dentro dessa molécula de ácido nucleico.

A necessidade do seqüenciamento de DNA foi tornada óbvia pela teoria de Francis Crick de que a sequência de nucleotídeos dentro de uma molécula de DNA influenciou diretamente as seqüências de aminoácidos das proteínas. Na época, a crença era que um genoma completamente sequenciado levaria a um salto quântico para entender a bioquímica de células e organismos.

O sequenciamento moderno de DNA consiste em métodos de alto rendimento que permitem que sequências inteiras de DNA sejam descobertas em questão de horas. Essa tecnologia permitiu que muitas empresas comecem a oferecer testes de DNA em casa. Muitos dos “resultados” encontrados por esses testes são simplesmente correlações encontradas entre uma variante genética e uma certa condição. No entanto, a tecnologia também permitiu que os cientistas testassem o DNA de muitos organismos para entender melhor as relações evolutivas.

Exemplo de sequenciamento de DNA

Embora o sequenciamento de DNA costumava levar anos, agora pode ser feito em horas. Além disso, a primeira sequência completa do DNA humano levou cerca de 3 bilhões de dólares. Agora, certas empresas sequenciarão todo o seu genoma por menos de US $ 1.000. Os testes mais avançados analisarão todos os nucleotídeos dentro do seu genoma. No entanto, muitas empresas agora oferecem testes de polimorfismo de nucleotídeo único.

Esses testes se concentram em nucleotídeos individuais em genes que podem significar certas variantes genéticas. Esses SNPs, como são conhecidos, foram correlacionados a certas condições e podem ajudar a prever como seus genes podem influenciar sua vida. Alguns SNPs estão relacionados a várias doenças, enquanto outros estão relacionados ao seu metabolismo e como seu corpo processa nutrientes. Milhares de correlações diferentes foram encontradas e o sequenciamento de DNA pode ser usado para descobrir como seu genoma afeta sua vida.

Métodos de sequenciamento de DNA

Existem dois tipos principais de sequenciamento de DNA. O método mais antigo de terminação em cadeia clássica também é chamado de método Sanger. Métodos mais recentes que podem processar um grande número de moléculas de DNA rapidamente são chamados de técnicas de sequenciamento de alto rendimento (HTS) ou métodos de sequenciamento de próxima geração (NGS).

Sequenciamento de Sanger

O método Sanger depende de um primer que se liga a uma molécula de DNA desnaturada e inicia a síntese de um polinucleotídeo de fita simples na presença de uma enzima de DNA polimerase, usando o DNA desnaturado como modelo. Na maioria das circunstâncias, a enzima catalisa a adição de um nucleotídeo. Uma ligação covalente, portanto, se forma entre o átomo de carbono 3 ‘da molécula de açúcar de desoxirribose em um nucleotídeo e o átomo de carbono 5’ do próximo. Esta imagem abaixo mostra como esse vínculo é formado.

Uma mistura de reação de seqüenciamento, no entanto, teria uma pequena proporção de nucleotídeos modificados que não podem formar essa ligação covalente devido à ausência de um grupo hidroxila reativo, dando origem ao termo ‘dideoxirribonucleotídeos’, isto é, eles não têm 2 ‘ou 3 ‘átomo de oxigênio quando comparado ao ribonucleotídeo correspondente. Isso encerraria a reação de polimerização do DNA prematuramente. No final de várias rodadas de tais polimerizações, seria criada uma mistura de moléculas de comprimentos variados.

Nas primeiras tentativas de usar o método Sanger, a molécula de DNA foi amplificada pela primeira vez usando um primer rotulado e depois dividido em quatro tubos de teste, cada um com apenas um tipo de DDNTP. Ou seja, cada mistura de reação teria apenas um tipo de nucleotídeo modificado que poderia causar terminação da cadeia. Após a conclusão das quatro reações, a mistura de moléculas de DNA criada pela terminação da cadeia passaria por eletroforese em um gel de poliacrilamida e se separaria de acordo com seu comprimento.

Na imagem acima, uma reação de sequenciamento com DDATP foi submetida a eletroforese através da primeira coluna. Cada linha representa uma molécula de DNA de um comprimento específico, o resultado de uma reação de polimerização que foi terminada pela adição de um nucleotídeo DDATP. A segunda, terceira e quarta colunas continham DDTTP, DDGTP e DDCTP, respectivamente.

Com o tempo, esse método foi modificado para que cada DDNTP tivesse um rótulo fluorescente diferente. O primer não era mais a fonte da etiqueta radiolabel ou fluorescente. Também conhecido como sequenciamento do terminador de corante, esse método usou quatro corantes com espectros de emissão de não sobreposição, um para cada DDNTP.

A imagem mostra a diferença entre os iniciadores marcados, os DNTPs rotulados e o Terminator NTPS tingido.

A imagem acima mostra uma representação esquemática do sequenciamento do terminador de corante. Há uma única mistura de reação que carrega todos os elementos necessários para o alongamento do DNA. A mistura de reação também contém pequenas concentrações de quatro DDNTPs, cada um com uma etiqueta fluorescente diferente. A reação concluída é executada em um gel capilar. Os resultados são obtidos através de uma análise dos espectros de emissão de cada banda de DNA no gel. Um programa de software analisa os espectros e apresenta a sequência da molécula de DNA.

Sequenciamento de alto rendimento

O sequenciamento de Sanger continua a ser útil para determinar as seqüências de trechos relativamente longos de DNA, especialmente em baixos volumes. No entanto, pode se tornar caro e trabalhoso quando um grande número de moléculas precisa ser sequenciado rapidamente. Ironicamente, embora o método tradicional do terminador de corante seja útil quando a molécula de DNA é mais longa, os métodos de alto rendimento se tornaram mais amplamente utilizados, especialmente quando os genomas inteiros precisam ser sequenciados.

Existem três alterações principais em comparação com o método Sanger. O primeiro foi o desenvolvimento de um sistema livre de células para clonar fragmentos de DNA. Tradicionalmente, o trecho do DNA que precisava ser sequenciado foi primeiro clonado em um plasmídeo procariótico e amplificado dentro de bactérias antes de ser extraído e purificado. As tecnologias de alta taxa de transferência ou de sequenciamento de próxima geração não se basearam mais nesse procedimento trabalhoso e intensivo de tempo.

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O advento do HTS expandiu bastante os pedidos de genômica. O sequenciamento de DNA agora se tornou parte integrante da ciência básica, pesquisa translacional, diagnóstico médico e forense.

Usos do sequenciamento de DNA

Atualmente, os métodos tradicionais de terminação em cadeia e os métodos HTS são usados para diferentes aplicações. O sequenciamento de Sanger agora é usado principalmente para sequenciamento inicial de novo de uma molécula de DNA para obter os dados de sequência primária para um organismo ou gene. As “leituras” relativamente curtas que saem de uma reação HTS (30-400 pares de bases em comparação com os quase mil pares de bases “leituras” dos métodos de sequenciamento de Sanger) dificultam a criação de todo o genoma de um organismo a partir dos métodos HTS. Ocasionalmente, o sequenciamento de Sanger também é necessário para validar os resultados do HTS.

Por outro lado, o HTS permite que o uso do sequenciamento de DNA compreenda polimorfismos de nucleotídeo único-entre os tipos mais comuns de variação genética dentro de uma população. Isso se torna importante na biologia evolutiva, bem como na detecção de genes mutados que podem resultar em doença. Por exemplo, variações de sequência em amostras de adenocarcinoma pulmonar permitiram a detecção de mutações raras associadas à doença. Os locais de ligação à cromatina para proteínas nucleares específicas também podem ser identificadas com precisão usando esses métodos

No geral, o sequenciamento de DNA está se tornando parte integrante de muitas aplicações diferentes.

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O sequenciamento do genoma é particularmente útil para identificar as causas de distúrbios genéticos raros. Embora mais de 7800 doenças estejam associadas a um padrão de herança mendeliana, menos de 4000 dessas doenças foram definitivamente ligadas a um gene ou mutação específico. A análise precoce do exon-genoma, ou exoma, que consiste em todos os genes expressos de um organismo, mostrou-se promissor na identificação dos alelos causais para muitas doenças herdadas. Em um caso particular, sequenciar o genoma de uma criança que sofre de uma forma grave de doença inflamatória intestinal ligou a doença a uma mutação em um gene associado à inflamação – XIAP. Enquanto o paciente mostrou inicialmente vários sintomas sugestivos de uma deficiência imunológica, um transplante de medula óssea foi recomendado com base nos resultados do sequenciamento de DNA. A criança se recuperou posteriormente da doença.

Além disso, o HTS tem sido um participante importante no desenvolvimento de uma maior compreensão de tumores e cânceres. Compreender a base genética de um tumor ou câncer permite que os médicos tenham uma ferramenta extra em seu kit para tomar decisões de diagnóstico. O Atlas do Genoma do Câncer e o Consórcio Internacional do Genoma do Câncer sequenciaram um grande número de tumores e demonstraram que esses crescimentos podem variar muito em termos de sua paisagem mutacional. Isso também deu uma melhor compreensão do tipo de opções de tratamento que são ideais para cada paciente. Por exemplo, o sequenciamento do genoma do câncer de mama identificou dois genes – BRCA1 e BRCA2 – cujas variantes patogênicas têm um enorme impacto na probabilidade de desenvolver câncer de mama. Pessoas com alguns alelos patogênicos até optam por ter cirurgias preventivas, como mastectomias duplas.

Biologia molecular

O sequenciamento de DNA agora é parte integrante da maioria dos laboratórios biológicos. É usado para verificar os resultados dos exercícios de clonagem para entender o efeito de genes específicos. As tecnologias HTS são usadas para estudar variações nas composições genéticas de plasmídeos, bactérias, leveduras, nematóides ou mesmo mamíferos usados em experimentos de laboratório. Por exemplo, uma linha celular derivada do tecido do câncer de mama, chamada HeLa, é usada em muitos laboratórios em todo o mundo e foi considerada anteriormente como uma linha celular confiável representando tecido mamário humano. Resultados recentes de sequenciamento demonstraram grandes variações no genoma das células HeLa de diferentes fontes, reduzindo assim sua utilidade na biologia celular e molecular.

O sequenciamento de DNA fornece uma visão dos elementos regulatórios dentro do genoma de todas as células e as variações em sua atividade em diferentes tipos de células e indivíduos. Por exemplo, um gene específico pode ser permanentemente desligado em alguns tecidos, enquanto é constitutivamente expresso em outros. Da mesma forma, aqueles com suscetibilidade a uma doença específica podem regular um gene de maneira diferente daqueles que são imunes. Essas diferenças nas regiões reguladoras do DNA podem ser demonstradas através do sequenciamento e podem fornecer informações sobre a base de um fenótipo.

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forense

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Questionário

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2. Aproximadamente, quanto custou para sequenciar inicialmente um genoma humano?

3. Qual organismo foi o primeiro a ter um genoma completamente sequenciado?

4. Qual das alternativas a seguir não é um uso para sequenciamento de DNA?

5. Por que a polícia usaria o sequenciamento de DNA?

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