Definição
Enzimas de restrição, endonucleases de restrição ou tesoura molecular são enzimas produzidas por bactérias que podem cortar entre duas cadeias de DNA em áreas chamadas locais de reconhecimento. As enzimas de restrição foram descobertas pela primeira vez durante a pesquisa de Enterobacteria coli. As enzimas de restrição do tipo II (RES) são de particular importância nos campos da clonagem molecular, sequenciamento de genes e mapeamento de DNA, pois esse grupo pode cortar o DNA muito próximo a locais de reconhecimento específicos e não requer energia na forma de ATP.
Função da enzima de restrição
A função da enzima de restrição no mundo natural é defender bactérias contra vírus específicos chamados bacteriófagos. Esses vírus atacam bactérias injetando RNA ou DNA viral em um plasmídeo bacteriano (pequeno anel roxo na imagem abaixo) e replicando lá. Se o RNA ou DNA viral for detectado dentro de uma célula de procariote, essa célula pode interromper o processo de replicação cortando as informações genéticas estrangeiras. Isso torna inútil. Ao mesmo tempo, o DNA bacteriano é protegido da ação de corte de suas endonucleases de restrição em seus locais de restrição. Esse mecanismo adiciona grupos metil (H3C) à citosina e adenina do DNA bacteriano sem afetar a sequência de DNA codificada.
Até o momento, aproximadamente 3500 enzimas de restrição foram isoladas de plasmídeos bacterianos. Cada enzima reconhece uma sequência específica de código genético viral e tentará separar a nova fita de DNA mutada perto ou mais longe do local de reconhecimento. Esse mecanismo de separação natural também é referido como digestão da enzima de restrição.
Não apenas o local e o método, mas também o tipo de corte podem diferir. Alguns res deixam pontas pegajosas irregulares (extremidades não negritas) entre áreas ligeiramente diferentes de uma fita dupla que overhang; Outros deixam as pontas bruscas onde os pares de bases são separados no mesmo ponto. Por exemplo, o Bamhi é uma enzima de restrição do tipo II obtida de Escherichia coli que reconhece a sequência de nucleotídeos GGATCC e cliva essas seções de DNA que deixam as extremidades pegajosas. A clivagem, como clivando um tronco com um machado, é o termo cientificamente aceito para cortar um fio de DNA.
Na imagem abaixo, uma enzima de restrição chamada Hindiii cliva o DNA em diferentes pontos nos dois fios para formar uma extremidade pegajosa.
Uma vez que a fita dupla de DNA foi separada, outra enzima chamada DNA ligase se junta ao backbone do DNA como uma ligação de extremidade pegajosa ou de ponta robusta. O DNA de fita simples que foi inserida no DNA bacteriano por vírus específicos pode ser removida por certos res. O DNA ligase então recombina o DNA construindo uma cópia espelhada da sequência bacteriana. Em suma, uma enzima de restrição cliva o DNA estrangeiro e o DNA ligase repara o intervalo para trazê -lo de volta à sua forma original.
Desde a descoberta de genes, maneiras de manipulá -las foram fortemente pesquisadas. A ação de remover uma sequência genética e substituí -la por outra é conhecida como recombinação de genes. Os locais de reconhecimento de enzimas de restrição curta geralmente numeram entre quatro a oito nucleotídeos. Isso torna as enzimas de restrição ideais para uso no campo da biologia molecular.
Os nucleotídeos no DNA consistem em uma nucleobase, um açúcar de desoxirribose e um grupo de fosfato. São os grupos de fosfato e açúcar que formam a espinha dorsal do DNA, mostrados aqui em azul e turquesa.
Grupos de enzimas de restrição
As enzimas de restrição natural são organizadas em cinco grupos: tipo I, II, III, IV e V. Tipo I, o primeiro a ser descoberto, corte sequências de DNA longe dos locais de reconhecimento e exigem que o ATP reconheça, modifique e/ou digestão Seções assimétricas. A distância do local de reconhecimento torna a restrição do tipo I endonucleases menos úteis no campo da engenharia genética.
As res reconhecem e cortam seções curtas de DNA próximas a locais de restrição sem ATP, mas usando íons magnésio. Por esse motivo, eles são as endonucleases de restrição natural mais usadas. As enzimas de restrição do tipo II são posteriormente categorizadas em subgrupos e um desses subgrupos é a categoria IIS de alta precisão.
A endonucleases de restrição do tipo III raramente são usadas na engenharia genética, pois cortam as sequências de DNA bem fora da sequência de reconhecimento e precisam detectar duas sequências separadas para conseguir isso. Isso significa que eles nem sempre são capazes de fornecer digestão completa da enzima de restrição. As nucleases de restrição do tipo IV podem apenas clivar o DNA metilado (o DNA que não é transcrito para uma proteína) e a especificidade da sequência é fraca.
As enzimas de restrição do tipo V requerem RNA-guia (GRNA) para atingir sequências específicas e são elas que estão sendo modificadas ou usadas em métodos de engenharia de genoma, como TALENS e CRISPR-CAS9. O CRISPR é a forma curta de aglomerados de repetições palindrômicas curtas regularmente intercaladas. As regiões CRISPR referem -se a padrões repetidos de nucleotídeos e espaçadores dentro de uma seção do DNA; É dentro dos espaçadores que os vírus incorporam seu DNA. Ao inserir outro código genético em um espaçador por meios artificiais, é possível modificar o genoma de um organismo vivo.
Finalmente, as enzimas de restrição artificial (ARES) estão se tornando cada vez mais populares entre os geneticistas, pois podem ser modificados para reconhecer e cortar sequências de DNA em locais predefinidos. CRISPR e TALENS usam enzimas de restrição adaptadas para maior precisão; Eles também podem editar muitos genes em um único processo. Além disso, as enzimas de restrição natural disponíveis comercialmente são limitadas em número, e esses DNA de fragmento em seções muito curtas; É raro que um laboratório menor tenha acesso às enzimas certas. Isso ocorre porque diferentes enzimas de restrição são necessárias para clicar as muitas áreas separadas do DNA que compõem o código para um único gene.
A recente síntese de enzimas de restrição artificial usando certas proteínas, como a proteína Argonaute (PFAGO), fornece uma técnica alternativa que pode clivar sequências de sequência de extremidade sticky mais longa com maior precisão.
Enzimas de restrição na clonagem molecular
Na clonagem molecular, os biólogos moleculares inserem um gene em uma pequena seção estável do DNA de um organismo, permitindo que ele seja replicado. Quando esse gene é expresso, a pesquisa sobre os efeitos desse gene nos organismos do estudo pode ser realizada.
A clonagem da enzima de restrição é uma das primeiras técnicas no campo da clonagem molecular, mas permanece popular devido a uma baixa relação custo / confiabilidade. Depois de produzir pontas pegajosas ou contundentes, o DNA clivado é purificado e inserido no DNA das bactérias hospedeiras em uma etapa chamada transformação. Após a transformação, o plasmídeo contém DNA recombinante (recombinado) – um termo usado para descrever a combinação de fragmentos de DNA extraídos com as enzimas da ligase de DNA. A ligase de DNA permite que esta seção seja fixada em um plasmídeo. Uma bactéria hospedeira pode então produzir mais DNA ou expressar o gene inserido após a síntese proteica.
Métodos mais recentes que não requerem enzimas de restrição natural, mas as versões sintéticas estão sendo cada vez mais implementadas. A técnica acima descrita é, portanto, comumente chamada de clonagem tradicional. A clonagem de DNA não deve ser confundida com o processo usado para criar dolly as ovelhas; Apenas pequenos fios de DNA são replicados na modificação de genes. Dolly foi o resultado de clonagem completa do genoma.
Enzimas de restrição no perfil de DNA
A descoberta de enzimas de restrição tornou possível o perfil do DNA. Os minisatélites são sequências curtas e repetitivas entre dez e sessenta pares de bases que mostram maior variação entre indivíduos do que outras seqüências no genoma. Essa variação é determinada pelo número de unidades repetidas (gagueias) dentro de uma sequência de minisatélites.
Vários minisatélites fornecem uma impressão digital de DNA que identifica um indivíduo. As formas anteriores de perfil de DNA usaram enzimas de restrição natural para cortar seções de vários porte em todo o DNA. A eletroforese em gel de campo pulsado separa essas seções prontas para identificação. As seções separadas representando minisatélites são transportadas em uma membrana e separadas para produzir fios únicos. Este procedimento requer fios opostos compostos por fósforo radioativo que se conecta aos seus fios complementares (correspondentes) na membrana. Um raio-X produziu uma imagem da impressão digital de DNA-uma imagem é possível devido à cópia radioativa de fósforo.
Hoje, os microssatélites de dois a cinco pares de bases são replicados muitas vezes através de uma técnica conhecida como reação em cadeia da polimerase. Esse método mais recente fornece resultados, mesmo com uma pequena amostra de DNA – algo que o método anterior não conseguiu fazer. Em vez de fósforo radioativo, o RNA do iniciador se liga às duas extremidades das seqüências de DNA cortadas que mostram a maior variação entre os indivíduos. Os iniciadores de RNA são rotulados com cores fluorescentes. Eletroforese em gel de campo pulsado, tipagem de sequência multiloco (MLST) e sequências de digitação amplificada polimórfica (PATs) são tecnologias usadas para separar os fragmentos resultantes. Os lasers fornecem diferentes comprimentos de onda de luz para produzir uma impressão digital de DNA colorida.
Embora o perfil de DNA esteja mais associado ao campo da ciência forense criminal, esse método de identificação também é usado para detectar cepas bacterianas responsáveis por doenças, fornecem uma impressão digital bacteriana que pode ser usada para isolar e tratar infecções ou determinar se alimentos ou lugares onde alimentos IS produzido está livre de bactérias patogênicas.
Usos tradicionais de clonagem de DNA
A clonagem tradicional de DNA usando endonucleases restritivas tem vários usos. O DNA recombinante expresso (sequências de DNA que codificam a síntese de proteínas), quando inseridas na informação genética das bactérias, estimulam bactérias para produzir a proteína alvo.
Este é o método pelo qual os engenheiros genéticos em empresas farmacêuticas fabricam insulina humana, albumina humana, algumas vacinas, anticorpos monoclonais e hormônio do crescimento humano a um custo muito menor que extraia esses produtos de organismos multicelulares. O DNA recombinante também é usado para diagnosticar doenças hereditárias e produzir antibióticos em grande escala.
A análise gênica é um setor amplo no qual os engenheiros genéticos inserem seqüências de DNA recombinantes clivadas (rDNA) para nos ajudar a entender o que os genes específicos fazem. Ao entender os genes, temos os dados necessários para fazer ajustes que possam potencialmente erradicar doenças.
As culturas geneticamente modificadas são o resultado das técnicas tradicionais de clonagem molecular, onde a resistência a insetos e herbicidas e mais produto por hectare quadrado são os principais objetivos. Este método também melhora a fixação de nitrogênio em plantas e culturas.
A indústria de catering usa DNA recombinante nos processos de fermentação e fabricação de queijos, e também para detectar a presença de bactérias patogênicas e fungos nas superfícies usadas para a preparação de alimentos.
No entanto, para produzir resultados que possam melhorar nossa saúde ou fontes de alimentos, nosso conhecimento da função de todo gene é essencial. Somente quando a função de uma sequência de DNA foi descoberta, ela pode ser usada corretamente. A clonagem tradicional de DNA foi a primeira técnica usada no campo do mapeamento do genoma que, ao longo de muitos anos, nos ensinou como os genes são expressos. Com novas enzimas de restrição artificial, a engenharia genética só pode avançar nas próximas décadas.
Bibliografia
Aparecer esconder
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Última atualização em 19 de agosto de 2022